Οι συνεχιζόμενες επιθέσεις των πειρατών της Αγίας Μαύρας προκάλεσαν την έντονη αντίδραση της Δημοκρατίας της Βενετίας. Προκειμένου λοιπόν, να καταστείλει την πειρατική δραστηριότητα γύρω από τη Λευκάδα, έστειλε το στόλο της με επικεφαλής τον Αρχιστράτηγο Francesco Morosini, ο οποίος αφίχθη στο κάστρο με δύναμη 10.000 ανδρών, στις 21 Ιουλίου 1684. Άμεσα ξεκίνησε την πολιορκία του με σφοδρό βομβαρδισμό των βόρειων και δυτικών τειχών, καθώς λόγω του μικρού πάχους ήταν πιο ευάλωτα. Για να κόψει το νερό των πολιορκημένων, κατέστρεψε μέρος του υδραγωγείου. Η ανατίναξη μίας πυριτιδαποθήκης, πλησίον του δυτικού τείχους, προκάλεσε την κατάρρευση μεγάλου τμήματος του, από το άνοιγμα του οποίου οι πολιορκητές εισέβαλαν εντός αυτού, με αποτέλεσμα οι Οθωμανοί να υποχρεωθούν σε συνθηκολόγηση.
Η συνθήκη παράδοσης του κάστρου υπεγράφη μεταξύ του Morosini και του Bekir Aga, Διοικητή της φρουράς, και προέβλεπε την ασφαλή μεταφορά των Οθωμανών στην Πρέβεζα. Άφηνε όμως εκτός τους 600 πειρατές, που θανατώθηκαν επί τόπου, κατόπιν εντολής του βενετού Αρχιστράτηγου.
Μετά την πολιορκία τα τρία ισλαμικά τεμένη, που είχαν ανεγερθεί εντός του κάστρου, μετατράπηκαν σε χριστιανικούς ναούς. Το τζαμί του Πασά μετατράπηκε σε καθολικό ναό που αφιερώθηκε στον Άγιο Σωτήρα, επειδή την ημέρα εορτής του καταλήφθηκε το κάστρο, ενώ το δεύτερο, το σουλτανικό, σε καθολικό ναό που αφιερώθηκε και πάλι στην Αγία Μαύρα. Στους δύο ναούς επιτρεπόταν η διεξαγωγή εκκλησιαστικών τελετών και των δύο χριστιανικών δογμάτων, προκειμένου να επιτευχθεί η αγαστή συνύπαρξη μεταξύ καθολικών και ορθοδόξων, που επιθυμούσε η βενετική διοίκηση του κάστρου.
Οι Ενετοί αποφάσισαν επίσης τη μεταφορά του οικισμού του κάστρου στην Αμαξική (1685). Μάλιστα, κατεδάφισαν όλες τις εντός και εκτός των τειχών κατοικίες και κατασκεύασαν κτήρια, που προορίζονταν για την εγκατάσταση των ενετικών διοικητικών και θρησκευτικών αρχών και του στρατού, όπως: οικία Τακτικού Προβλεπτή, κελί και μονή Φραγκισκανών, στρατώνας και πυριτιδαποθήκη.
To 1715 oι Βενετοί αποσύρουν τα στρατεύματά τους από το κάστρο, για να στείλουν ενισχύσεις στο φρούριο της Κέρκυρας, που επρόκειτο να δεχθεί επίθεση από τον οθωμανικό στόλο. Την ημέρα της αποχώρησή τους, o Γενικός Προβλεπτής της Θάλασσας, Daniele Dolfin, παίρνει μαζί του όλα τα κανόνια και τα πυρομαχικά και ανατινάζει τα τείχη της Αγίας Μαύρας σε καίρια σημεία, ώστε να αποδυναμωθεί εντελώς η άμυνα. Μόλις οι Οθωμανοί πληροφορούνται την εκκένωση του κάστρου, στέλνουν μονάδα ιππικού και το καταλαμβάνουν χωρίς αντίσταση.
Στις 18 Οκτωβρίου 1716, με αρχηγό τον Γενικό Προβλεπτή της Θάλασσας Πιζάνι (Pisani), ο στόλος των Βενετών φθάνει έξω από τα επιθαλάσσια τείχη του κάστρου. Στη θέα του, οι 20 Οθωμανοί φρουροί του πανικοβάλλονται και τρέπονται σε φυγή με κατεύθυνση την Ακαρνανία. Οι Βενετοί γίνονται ξανά κύριοι του κάστρου της Αγίας Μαύρας και προβαίνουν σε επισκευές.
Το 1718 η Γαληνοτάτη Δημοκρατία της Βενετίας αναθέτει στον Γερμανό Στρατηγό Σούλεμπουργκ (Schulenburg) να ενισχύσει την οχύρωση του κάστρου, στοχεύοντας κυρίως στην προάσπιση του ανατολικού και δυτικού αμυντικού μετώπου, των πλέον εκτεθειμένων στα εχθρικά πυρά.
Έτσι, ενισχύθηκαν τα τείχη στα πιο ευπρόσβλητα τμήματά τους με επιχωματώσεις, ενώ στο πάχος αυτών διανοίχθηκαν θολοσκεπείς στοές, που εξοπλίστηκαν με κανόνια για να λειτουργήσουν ως πυροβολεία. Τα Ν – ΝΔ τείχη φαίνεται ότι δέχθηκαν τις λιγότερες ενισχύσεις, εφόσον καμία πολιορκία δεν μαρτυρείται μπροστά από αυτή την πλευρά.
Ακολουθώντας τα πρότυπα και τις καινοτόμες λύσεις των ευρωπαϊκών οχυρώσεων της εποχής, η προμαχωνική οχύρωση της Λευκάδας αποκρυσταλλώνεται. Τα τριγωνικά προτειχίσματα και οι ένυδρες τάφροι, που περιέκλεισαν το φρούριο, κατά το πιο εξελιγμένο αμυντικό σύστημα, αποτελούσαν πλέον την πρώτη γραμμή άμυνας, δημιουργώντας ένα προστατευτικό κέλυφος πέριξ του κάστρου. Επιπλέον, γίνεται αναπροσαρμογή του αμυντικού συστήματος των δύο πυλών, σύμφωνα με τα ενετικά πρότυπα. Μία ακόμη αξιοσημείωτη προσθήκη της συγκεκρι μένης περιόδου είναι η κατασκευή του τραπεζιόσχημου προμαχώνα, στη συμβολή της ημισελήνου με το ανατολικό μέτωπο του κάστρου. Ανάλογη μορφή είχε λάβει λίγο νωρίτερα και ο προμαχώνας στα ΝΑ, έπειτα από μετασκευή της αρχικής κυκλικής μορφής του. To 1719 o Σούλεμπουργκ χτίζει ένα επίμηκες κτήριο στρατώνων στο εσωτερικό του προμαχώνα του Αγίου Φραγκίσκου, εφαπτόμενο στο τείχος.
Στο διάστημα από το 1725 έως το 1797 το κάστρο λαμβάνει τη μεγαλύτερη έκτασή του, χωρίς ωστόσο να αλλάζει σημαντικά το περίγραμμά του. Η πιο σημαντική διαφοροποίηση είναι η κατάργηση του αρχικού εσωτερικού πυρήνα του, με τη σταδιακή κατεδάφιση και «εξαφάνιση» της ακρόπολης.
